·基础与临床·

作者：郑敏 刘必成

作者单位：210009 江苏省南京市，东南大学附属中大医院肾科?

通讯作者：刘必成，E-mail:liubc64@yahoo.com.cn

【关键词】糖尿病肾病;生物标志物

糖尿病肾病(DN)是造成终末期肾病(ESRD)的主要原因之一，众多因素参与并调控了DN的发生发展。目前临床上反应DN的生物标志物主要为尿白蛋白(UAlb)，其具有明显的缺陷，因此筛选早期DN生物标志物的研究有助于更好地理解DN的发生及进展机制，从而更好地指导治疗。本文就DN生物标志物研究的最新进展进行介绍。

一、DN及其发病机制?

DN是糖尿病常见和严重的微血管并发症，是糖尿病患者主要的死亡原因之一。30%~50%的1型糖尿病(T1DM)患者及20%的2型糖尿病(T2DM)患者伴随显著的肾功能损害[1]。在发达国家DN已成为ESRD的首位病因。DN特征性的病理改变为细胞外基质堆积、肾小球硬化及小管间质纤维化。其确切发病机制目前尚未阐明，可归纳为以下几个方面。(1)肾内血流动力学异常：DN患者肾小球出现高压力、高滤过、高灌注、肾小球毛细血管基底膜增厚、细胞肥大、系膜扩张[2]。(2)糖基化终末产物(AGEs)：长期高血糖导致体内多种氨基酸及蛋白质发生非酶性糖基化而形成AGEs，与肾小球系膜细胞AGEs受体结合致使细胞外基质及纤连蛋白堆积，造成肾小球肥大和硬化。(3)多元醇代谢通路激活：高血糖使肾脏组织细胞内葡萄糖水平不受胰岛素调控而与血糖平行，细胞内高浓度葡萄糖激活醛糖还原酶，生成不易透过细胞膜的强极性化合物山梨醇，致使细胞肿胀、功能受损、肌醇减少、Na+K+ATP酶活性下降，最终导致细胞代谢及功能损害。(4)炎症反应：多种途径导致的单核细胞趋化蛋白(MCP-1)表达上调，巨噬细胞浸润，释放炎症介质和细胞因子，均可加速肾脏损伤[3]。(5)足细胞数目减少和密度降低与UAlb呈显著负相关，足细胞减少严重者肾小球硬化及血清肌酐(SCr)水平明显升高。此外，足细胞相关分子(裂孔膜由nephrin、podocin、CD2AP、FAT、P-cadherin等多种蛋白质组成，被称为“足细胞相关分子”)表达的改变，将导致肾小球滤过屏障结构和功能的异常，从而加速UAlb排出和肾小球硬化。此外，遗传因素、免疫损伤、脂代谢紊乱以及氧化应激等都在DN的发生发展中起重要的作用。

二、生物标志物定义?

生物标志物是指可以客观测得的以评估生理、病理过程及机体对治疗反应的生物学指标。它可以是患者可测得的任何一项参数，如mRNA表达谱、蛋白质、蛋白质组类型以及电信号等。理想的生物学标志物应当具备准确、无创、容易实施、与生物学过程相关并利于对该过程病理生理学机制的理解等特征。

三、DN生物标志物研究?

目前临床上最常用DN生物标志物为UAlb，但其并非DN特异性，它可出现在非DN病理条件下，且仅30%~45%的患者10年后发展为临床白蛋白尿[4]。此外，传统方法检测的UAlb仅为具有免疫活性的白蛋白，非免疫活性的白蛋白尚无法检测[5]。因此UAlb远不能作为预测DN的理想的生物标志物，因此探索更敏感更理想的DN生物标志物成为目前研究的热点，且大量的研究也初步筛选出了有可能成为DN生物标志物的指标。

1.足细胞及nephrin：足细胞是肾小球滤过膜的主要组成成分，因此足细胞及足细胞特异性蛋白表达的改变可以作为肾小球病变早期重要的预测指标。尿液足细胞仅可在伴微量白蛋白尿及临床白蛋白尿的DN患者中检出，而不出现在正常对照、不伴白蛋白尿的T2DM患者及慢性肾功能不全的患者中[6]。Nephrin是主要的足细胞特异性蛋白，Patari等[7]对T1DM患者尿液研究发现，分别有30%正常白蛋白尿、17%微量白蛋白尿、28%临床白蛋白尿以及28%新近出现微量白蛋白尿的糖尿病患者检出免疫活性的nephrin，非糖尿病患者均未检出。

2.结缔组织生长因子(CTGF)：已证实CTGF在糖尿病大鼠模型早期肾脏肥大中发挥重要作用[8]。Nguyen等[9]对318例T1DM患者及29名血糖正常对照者进行了大规模的横断面研究，利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测尿液CTGF(U-CTGF)浓度。DN患者U-CTGF(平均155 pmol/24 h)显著高于微量白蛋白尿组(100 pmol/24 h)、正常白蛋白尿组(85 pmol/24 h)及健康对照组，且与尿白蛋白排泄率(UAER，r=0.31)及肾小球滤过率(GFR，r=-0.38)相关。标准化U-CTGF的升高与DN相关(优势比为3.9)。该项研究显示CTGF可能在DN的进展中发挥重要的作用。最近Nguyen等[10]证实血浆CTGF对于T1DM患者ESRD的发生也具有较好的预测价值。

3.N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)：尿NAG由于在UAlb升高及肌酐清除率下降之前已经出现升高而被认为是早期小管损伤的标志。Mohammadi?Karakani等[11]对32例糖尿病患者及25名健康对照者检测尿NAG、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(AP)、尿素氮、肌酐、HbA1c，结果显示，与对照组相比，糖尿病组的尿NAG、AP、LDH排泄及微量白蛋白尿显著增高，其中NAG排泄与其他标志物相比敏感性及特异性最高(分别为100%及87.5%)。因此，常规检测尿NAG排泄可能为DN的早期诊断提供重要的价值。

4.视黄醇结合蛋白(RBP)、免疫球蛋白G(IgG)、血浆铜蓝蛋白(CRL)、转铁蛋白(Tf)：Cabre等[12]在测定165例不伴有白蛋白尿及严重GFR下降的T2DM患者血浆RBP后发现，其浓度与血浆肌酐水平呈正相关(r=0.322,P<0.01)，而与GFR成呈相关(r=-0.468, P=0.009)。肾损害严重的患者[GFR<60 ml·min-1·(1.73 m2)-1]血浆RBP浓度显著高于GFR轻中度下降者。该结果显示RBP可能为糖尿病肾脏损害的标志物之一。Narita等[13]对140例正常白蛋白尿的T2DM患者进行5年随访研究发现，IgG、CRL、Tf在正常白蛋白尿向微量白蛋白尿的进展过程中具有重要的预测价值，而且与UAER相比，这些蛋白可能成为肾脏血流动力学改变更为敏感的指标。?

5.Smad1：Mima等[14]在证实了Smad1为胶原4合成的重要转录调节因子后，发现在链脲佐菌素(STZ)糖尿病大鼠模型中，4周龄大鼠尿Smad1升高与24周时系膜基质堆积较白蛋白尿(r=0.31，P=0.043)具有更好的相关性(r=0.70，P<0.01);同样在db/db鼠模型中发现糖尿病早期尿Smad1升高与继而肾小球硬化的进展具有良好的相关性。该实验提示Smad1可能为DN肾脏形态学改变的早期预测因子

6.氨基葡聚糖(GAG)：GAG为细胞质膜及胞外基质的重要成分，对维持肾小球基底膜通透性起重要作用。 Poplawska-Kita等[15]在对86例糖尿病患者与正常对照的研究中发现，糖尿病患者尿GAG 排泄较正常对照组增加(66.47 mg/24 h vs 50.11 mg/24 h)，其中DN患者尿GAG排泄[(74.66±7.5)mg/24 h]较非DN的糖尿病患者[(50.13±5.37)mg/24 h]亦显著升高，尿GAG与DN发展呈正相关。因此尿GAG检测对于DN的早期诊断也可能发挥重要的作用。

7.慢性炎症相关因子：已证实慢性炎症在DN的发生发展中具有重要作用。最近Hwang等[16]对T2DM患者多种慢性炎症因子进行研究发现，在糖尿病早期包括IL-6、C反应蛋白(C-RP)、黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-选择素)的多种炎症相关因子轻度升高，随着糖尿病进展及并发症的增多，这些炎症因子亦显著增高。Bavbek等[17]最近也发现糖尿病伴白蛋白尿患者血浆P?选择素及E-选择素较不伴白蛋白尿患者升高。因此，慢性炎症相关因子不仅对糖尿病进展发挥作用，也可对其并发症的出现起到预示作用。

8.氧化应激参数：活性氧簇在DN发生中亦发挥重要作用。Cvetkovic等[18]对DN患者血浆及尿液氧化应激参数丙二酰硫脲活性物质(TBARS)活性羰基衍生物(RCDs)及总巯基(TSHGs)研究发现，DN患者血浆及尿液TBARS、RCDs显著升高，而TSHGs在除临床白蛋白尿的T2DM患者尿液中升高外，其余均出现下降。因此TBARS、RCDs、TSHGs可能作为反应DN氧化应激损伤的生物标志物。

四、DN生物标志物的蛋白质组学研究?

传统的对生物学样本蛋白质的研究主要依赖于免疫学方法(Western blotting、ELISA、放射免疫法等)，它们有如下缺陷。首先，单次实验仅能分析少量蛋白种类;其次，必须获得待检测蛋白的抗体;再次，研究的蛋白对象都基于事先的假设。而更好地了解某一疾病的发生发展机制，必须有一种能够同时检测细胞、组织、器官、生物学液体中已知及未知蛋白的方法。蛋白质组学是对生物体各种组织或生物液体中蛋白质表达情况进行研究的新兴学科，近年来蛋白分离、鉴定、定量等蛋白质组学技术的进展为对组织及生物液体的蛋白质进行全面研究提供了一个崭新的平台。

Paturi等[19]利用二维凝胶电泳及液相层析?串联质谱技术对正常、微量及临床白蛋白尿的T2DM患者尿液蛋白质组学进行比较，鉴定了属于细胞发育、细胞构成、防御反应及信号转导等功能家族的62种蛋白。对对照组以及不同程度肾损害糖尿病患者进行比较显示出其在蛋白表达上的差异：糖尿病伴临床白蛋白尿患者与不伴白蛋白尿患者相比，7种蛋白α1B-糖蛋白、锌-α2-糖蛋白、α2-HS-糖蛋白、维生素D-结合蛋白(VDBP)、钙颗粒素B、α1-抗胰蛋白酶 (A1AT)以及血红素蛋白分别上升7.0、5.9、4.7、4.8、3.9、2.9、2.4 倍，与对照组相比分别上升VDBP (11.1倍)、锌-α2-糖蛋白(6.0倍)、α2-HS-糖蛋白(2.3倍)及A1AT (2.2倍)。糖尿病伴临床白蛋白尿患者与不伴白蛋白尿患者相比4种蛋白分别下降Transthyretin (4.3倍)、载脂蛋白A-I (3.2倍)、α1-microglobulin/bikunin precursor (AMBP) (1.61倍)及RBP(1.52倍)。该实验证实了蛋白质组学研究在DN生物标志物的研究中将发挥重要作用。

Cho等[20]利用二维凝胶电泳以及电喷雾-四级杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF MS/MS)技术比较30例微量白蛋白尿及30例正常白蛋白尿T2DM患者的尿液蛋白表达谱。与正常白蛋白尿组相比，微量白蛋白尿的组VDBP、色素上皮衍化因子(PEDF)、补体因子H相关1升高，补体复合物C4a、前载脂蛋白A1、MASP-2相关蛋白、RBP、ficolin3、谷胱甘肽过氧化物酶降低。利用Western blotting比较糖尿病不同时期DBP及PEDF表达差异，尤其是VDBP在微量白蛋白尿的DN患者中显著升高。结果提示VDBP可能将作为诊断DN重要的生物标志物。?

最近Rossing等[21]利用高分辨率毛细管电泳及电喷雾电离质谱法研究显示，一个数量为40的生物标志物组区分糖尿病及正常对照的灵敏度及特异性分别为89%及91%。比较糖尿病伴正常白蛋白尿及DN患者，102种尿液标记物呈现显著差异，其中65种标记物正确鉴定DN的灵敏度及特异性达到97%。此外，利用该生物标志物组能鉴定出3年后进展为显著DN的糖尿病患者。

五、生物标志物的临床应用?

当筛选出可能的生物标志物后，必须对其能否检测某种疾病行临床分析及临床实用性验证。选取最优化的分析方案，对标准方法获取的样本进行独立分析，检测该生物标志物正确区分疾病与正常人群及疾病不同阶段的能力，计算其准确度、灵敏度、特异性及ROC曲线下面积。同时，必须进行多中心研究以评估其可重复性及通用性。此后，需进行大规模的回顾性及前瞻性研究来证实所选取的生物标志物是否能够对疾病进行有效的早期诊断从而体现早期生物标志物研究的意义，即降低疾病的发生率、死亡率以及疾病对社会造成的巨大的经济负担。

六、总结?

DN由于其高致残率与死亡率已成为继心血管病、肿瘤之后威胁人类健康的主要疾病。早期诊断对于DN的治疗及其预后具有积极的意义，但目前临床尚缺乏对其进行早期诊断的生物标志物。近年来，包括蛋白质组学技术在内的各项技术对DN相关生物标志物进行了大量研究，初步筛选出了可能作为DN标志物的指标，当进一步对这些可能的指标充分地进行临床分析及临床实用性评价证实其诊断价值后，将会对DN的早期诊断及治疗手段的革新发挥积极的作用。